體外哺乳動物細胞TK基因突變試驗方法及導則

TK基因突變試驗的檢測終點是TK基因的突變。TK基因突變屬于常染色體基因突變。TK基因的產(chǎn)物胸苷激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反應。在正常情況下，此反應并非生命所必需，原因是體內(nèi)的TMP主要來自于脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應生成TMP。但如在細胞培養(yǎng)物中加入胸苷類似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進而摻入DNA，造成致死性突變,故細胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變，導致胸苷激酶缺陷,則TFT不能磷酸化，亦不能摻DNA，故突變細胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長，即表現(xiàn)出對TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù)可計算突變頻率，從而推斷受試物的致突變性。在TK基因突變試驗結(jié)果觀察中可發(fā)現(xiàn)兩類明顯不同集落，即大/小集落(L5178Y細胞)或正常生長/緩慢生長集落(TK6細胞)，有研究表明，大集落/正常生長集落主要由點突變或較小范圍的缺失等引起，而小集落/緩慢生長集落主要由較大范圍的染色體畸變，或由涉及調(diào)控細胞增殖的基因缺失引起。

北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對小鼠淋巴瘤細胞TK基因突變試驗開發(fā)染TK基因突變試劑盒，本試劑盒針對小鼠淋巴瘤細胞L5178Y開展TK基因突變試驗，試劑盒省去了陽性底物成分、篩選培養(yǎng)基準備、誘導 S9 制備，可以直接使用，大大縮短了實驗周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，無雜菌污染，誘導 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤細胞TK基因突變試驗要求，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。染色體畸變試驗試劑盒應用廣泛，可進行食品、化學品、農(nóng)藥、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個方面的遺傳毒理學檢測。

TK基因突變試驗導則

1  范圍

本標準規(guī)定了體外哺乳類胸苷激旃(thymidine kinase TK)基因突變試驗的基本試驗方法與技術(shù)要求。

本標準適用于評價受試物的致突變作用術(shù)語和定義TK基因哺乳類動物的胸苷激基因。

2  術(shù)語和定義

2.1  TK基因

人類的TK基因定位于17號染色體長臂遠端；小鼠的則定位于號染色體。

2.2  突變頻率

在某種細胞系中，某一特定基因突變型的細胞(集落)占細胞(集落)總數(shù)的比例(單位通常為10^-6)。

3  原理

TK基因突變試驗的檢測終點是TK基因的突變。TK基因突變屬于常染色體基因突變。

TK基因的產(chǎn)物胸苷激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反應。在正常情況下，此反應并非生命所必需，原因是體內(nèi)的TMP主要來自于脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應生成TMP。但如在細胞培養(yǎng)物中加入胸苷類似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進而摻入DNA，造成致死性突變,故細胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變，導致胸苷激酶缺陷,則TFT不能磷酸化，亦不能摻DNA，故突變細胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長，即表現(xiàn)出對TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù)可計算突變頻率，從而推斷受試物的致突變性。在TK基因突變試驗結(jié)果觀察中可發(fā)現(xiàn)兩類明顯不同集落，即大/小集落(L5178Y細胞)或正常生長/緩慢生長集落(TK6細胞)，有研究表明，大集落/正常生長集落主要由點突變或較小范圍的缺失等引起，而小集落/緩慢生長集落主要由較大范圍的染色體畸變，或由涉及調(diào)控細胞增殖的基因缺失引起。

4  儀器和設(shè)備

   培養(yǎng)箱、恒溫水浴、二氧化碳培養(yǎng)箱、壓力蒸汽消毒器、、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、生物安全柜、倒置顯微鏡、離心機、無菌細胞培養(yǎng)瓶，玻璃器皿等。

5  培養(yǎng)基

5.1  *培養(yǎng)基

RPMI1640培養(yǎng)液，加入10%馬血清(培養(yǎng)瓶培養(yǎng))或20%馬血清(96孔板培養(yǎng))及適量抗菌素(青霉素、鏈霉素的終濃度分別為100IU/mL及100μg/mL。

5.2  THMG和TMG選擇培養(yǎng)基THMG培養(yǎng)基

THMG培養(yǎng)基：3μg/mL胸腺嘧啶核苷( thymidine,T)+5μg/mL次黃嘌呤( hypoxanthine,H)+0.1μg/mL氨甲喋昤( methotrexate,M)+7.5μg/mL甘氨酸( glycine,G)。

THG培養(yǎng)基：3μg/mL胸腺嘧啶核苷(T)+5μg/mL次黃嘌昤(H)+7.5μg/mL甘氨酸(G)。

以上濃度為各試劑在培養(yǎng)基中的終濃度。實際試驗中,常按照表1的方法把THMG和THG配成100倍濃度，在試劑盒中即為100倍濃度。

6  試驗方法

6.1  細胞和培養(yǎng)條件

TK^+/-型的L5178Y-3.7.2C小鼠淋巴瘤細胞或TK6人類淋巴母細胞。

兩種細胞均在5%二氧化碳、37℃、飽和濕度條件下作常規(guī)懸浮培養(yǎng)。

為避免在培養(yǎng)和傳代期間自發(fā)突變的細胞對試驗結(jié)果的影響，在正式試驗前，應清除自發(fā)突變的TK^-/-基因型細胞。方法是：

a) 對于L5178Y細胞，使用THMG培養(yǎng)基處理24h，以800r/min~1000r/minm的速度離心4~6min、洗滌后在不含氨甲喋呤的THG培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d；

b) 對于TK6細胞,使用CHAT培養(yǎng)基處理48h，以800r/min~1000r/min的速度離心4~6min、洗滌后在不含氨基喋呤的CHT培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3d。

6.2  受試物

6.2.1  受試物的配制

固體受試物應溶于或懸浮于適當?shù)娜軇┗蛸x形劑中，在處理細胞前適當稀釋。液體受試物可直接加至試驗系統(tǒng)和或于染毒前稀釋。應該使用新鮮制備的受試物，除非穩(wěn)定性資料證實可以貯存。

6.2.2  受試物劑量設(shè)定

至少應設(shè)置3個~4個可供分析的濃度。對于有細胞毒性的受試物，應根據(jù)細胞毒性預試驗結(jié)果在RS或RSG為20%~80%范圍內(nèi)設(shè)3個~4個劑量(濃度)水平，同時應該考慮受試物對溶解度、pH和摩爾滲透壓濃度的影響。方法是：取生長良好的細胞，調(diào)整密度為5×10⁵/mL,按1%體積加入不同濃度受試物，37℃震搖處理3h(L5178Y細胞)或4h(TK6細胞)，細胞經(jīng)離心洗滌后，作2d(L5178Y細胞)或3d(TK6細胞)表達培養(yǎng)，每天計數(shù)細胞密度并計算相對懸浮生長(RSG)?；蛉∩鲜鎏幚砗蠹毎麘乙?，作梯度稀釋至8個細胞/mL，接種96孔板(每孔加0.2mL,即平均1,6個細胞/孔),每個劑量種1塊~2塊平板,，37℃，5%二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d，計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)，計算相對存活率(RS)。

對于細胞毒性極低的受試物，gao濃度應設(shè)為5mg/ mL、5uL/mL或0.01mol/L.。對于相對不溶解的物質(zhì)，其gao濃度的設(shè)置應達到不影響細胞培養(yǎng)的大可加入濃度。

6.2.3  對照

一般情況下，每一項試驗中，在代謝活化系統(tǒng)存在和不存在的條件下均應設(shè)陽性和陰性(溶媒)對照瓶組。

當使用代謝活化系統(tǒng)時，陽性對照物應使用要求代謝活化、并能引起典型突變集落的物質(zhì)，可以使用3-甲基膽(3- methyleholanthrene)、環(huán)磷酰胺( cyclophosphamide,CP)等。在沒有代謝活化系統(tǒng)時陽性對照物可使用甲基磺酸甲酯( methyl methane sulfonate,MMS)、絲裂莓素C( mitomycin C,MMC)、甲基磺酸乙酯( ethylmethane sulfonate,EMS)等使用其他適宜的陽性對照物。

溶媒應是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學反應，不影響細胞存活和S9活性。溶媒首先選擇蒸餾水，如使用非水溶媒（可選擇二甲基亞砜、丙酮、乙醇等），則需增設(shè)溶媒對照。

6.3  處理

取生長良好的細胞，調(diào)整密度為5×10⁵/mL，按1%體積加入受試物(需代謝活化的情況下，同時加終濃度為10%的S9混合物)，37℃振搖處理3h（L5178Y細胞）或4h(TK6細胞)，以800~100r/min的速度離心4min-6min，棄上清液，用PBS或不含血清的培養(yǎng)基洗滌細胞2遍，重新懸浮細胞于含10%馬血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，并調(diào)整細胞密度為2×10⁵/mL。

6.4  PE₀（0d的平板接種效率）測定

取適量細胞懸液，作梯度稀釋至8個細胞/mL，接種96孔板(每孔加0.2mL，即平均1.6個細胞/孔)，每個劑量種1塊~2塊平板，37℃，5%二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d。計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)。

6.5  表達

取6.3所得細胞懸液，作2d(1L5178Y細胞)或3d(TK6細胞)表達培養(yǎng)，每天計數(shù)細胞密度并保持密度在10⁶/mL以下，計算相對懸浮生長(RSG)。

6.6  PE₂(L5178Y細胞)或PE₃ (TK6細胞)測定

表達培養(yǎng)結(jié)束后,取適量細胞懸液,按6.4方法測定PE₂/ PE₃。

6.7  突變頻率（MF）測定

6.7.1  L5178Y細胞

L5178Y細胞表達培養(yǎng)2d后，取適量細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×10⁴/mL，加人TFT(終濃度為3ug/mL.)，混勻，接種96孔板(每孔加0.2mL，即平均2000個細胞/孔)，每個劑量作2塊~4塊板，37℃，5%二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d，計數(shù)有突變集落生長的孔數(shù)。突變集落按大集落Large Colony,LC：直徑≥1/4孔徑，密度低)和小集落(small colony，SC：直徑<1/4孔徑，密度高)分別計數(shù)。極小集落可再繼續(xù)培養(yǎng)3d后計數(shù).

7  大鼠肝微粒體酶的誘導和S₉的制備

7.1  誘導

廣泛應用的大鼠肝微粒體酶的誘導劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物），選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導劑，劑量為500mg/kg體重。誘導劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL。苯巴bi妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合也可做為誘導劑。

•  S₉制備

動物誘導后第五日斷頭處死。處死前12h停止飲食，但可自由飲水。首先，用75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的0.15mol/L氯化甲溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化甲溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化甲溶液3mL。用電動勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S₉）分裝于塑料管中。每管裝2 mL ~3 mL。儲存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中備用。

上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進行。制備肝S₉所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S₉制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進行鑒定。大鼠肝微粒體肝S9制備過程時間較久，也可以直接聯(lián)系北京匯智泰康購買現(xiàn)有肝微粒體，肝S9，NADPH再生系統(tǒng)，UGT孵育系統(tǒng)等產(chǎn)品。

8  數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價

8.1  數(shù)據(jù)處理

8.1.1  平板效率（PE₀、PE₂）

其中，EW為無集落孔數(shù)，TW為總的孔數(shù)，1.6為每孔接種細胞數(shù)。

8.1.2  相對存活率（RS）：

8.1.3  相對懸浮生長（RSG）每日細胞增長率（DGG）：

8.1.4  相對懸浮生長（RSG）

8.1.5  相對總生長（relative total growth，RTG）

其中，RSn 第2天（L5178Y細胞）的相對存活率。

8.1.6  突變頻率（MF）

其中，EW——96孔板無集落孔數(shù)；

TW——96孔板總的孔數(shù)；

N——每孔接種細胞數(shù)（此處N=2000），

PE2——第2天L5178Y細胞的平板效率。

此外，對于L5178Y細胞，可分別計算大集落突變率(L-MF)、小集落突變頻率(S-MF)和總突變頻率(T-MF)。對于TK6細胞，可分別計算正常集落突變頻率(N-MF)，緩慢生長集落突變頻率S-MF)和總突變頻率(T-MF)。

8.1.7  小集落突變百分率

8.2  結(jié)果評價

8.2.1  試驗成立條件

試驗所用L5178Y細胞的自發(fā)突変頻率應在50X10^-6~200X10^-6之間；TK6細胞的自發(fā)突變頻率應在1.5X10^-6~5.5X10^-6之間，同時自發(fā)突變頻率應在本實驗室歷史記錄范圍內(nèi)。陰性/溶媒對照的PE₀在60%~140%之間，PE₂/ PE₃的值在70%~130%之間。陽性對照的T-MF與陰性/溶媒對照有顯著差異，或是陰性/溶媒對照3倍以上。

8.2.2  受試物陽性和陰性結(jié)果的判定

與陰性照組相比較，在所有染毒條件下，一個或多個劑量水平上基因突變頻率差值超過126.0×10-6（總評價因子，GEF）。

試驗樣品所誘發(fā)的基因突變頻率出現(xiàn)濃度依賴性的增加。 

結(jié)果同時滿足上述標準，判定為陽性結(jié)果；否則，判定為陰性結(jié)果

•  試驗的解釋

TK基因突變試驗具有較高的敏感性，可檢出包括點突變、大的缺失、重組、異倍體和其他較大范圍基因組改變在內(nèi)的多種遺傳改變，長時間處理還可檢出某些斷裂劑、紡錘體毒物和多倍體誘導劑等。但體外試驗不能*模擬哺乳動物體內(nèi)代謝條件，因此，本試驗結(jié)果不能直接外推到哺乳動物。陽性結(jié)果表明受試樣品在該試驗條件下可引起所用哺乳類細胞基因突變；陰性結(jié)果表明在該試驗條件下受試樣品不引起所用哺乳類細胞基因突變。評價時應綜合考慮生物學意義和統(tǒng)計學意義。
匯智泰康TK基因突變試劑盒優(yōu)勢
北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對小鼠淋巴瘤細胞TK基因突變試驗開發(fā)染TK基因突變試劑盒。

便捷—— 本試劑盒省去了誘導 S9 制備，陽性底物、篩選培養(yǎng)基的配制和濃度條件摸索的時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。 準確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，無雜菌污染，誘導 S9 活性均符合L5178Y細胞基因突變試驗要求，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強、易于運輸和保存。

常見問題及原因分析
1、細胞自發(fā)突變范圍不在5010^-6~20010^-6之間：需要再做一次細胞自發(fā)突變清除，直至自發(fā)突變在 5010^-6~20010^-6
2、工作量較大：可以將有代謝活化和無代謝活化試驗分開進行，減小工作量，確保試驗準確性。

TK基因突變試劑盒使用說明書

【試驗原理】

TK基因突變試驗的檢測終點是TK基因的突變。在細胞培養(yǎng)物中加入三氟胸苷（TFT），則TFT在胸苷激酶的催化下生成三氟胸苷酸，進而參入DNA，造成致死性突變，細胞不能存活；若TK基因發(fā)生突變，導致細胞胸苷激酶（TK）缺陷，則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA，突變細胞表現(xiàn)出對TFT抗性，在TFT存在條件下仍能生長。在有或無代謝活化的條件下，將細胞培養(yǎng)物暴露于受試物適當時間，經(jīng)適當?shù)呐囵B(yǎng)時間，計數(shù)集落，計算突變頻率，從而推斷受試物致突變性。

【產(chǎn)品說明】

匯智泰康TK基因突變試劑盒提供進行體外哺乳動物細胞TK基因突變試驗所需的主要試劑和細胞，可用于評價受試物的致突變作用。其中所用細胞和試劑均符合國標要求，且在國標的基礎(chǔ)上引入了MTT染色法，使的結(jié)果觀察更為直觀，為實驗結(jié)果的可靠性提供了支持。

【產(chǎn)品使用說明】

1、細胞復蘇

從-70冰箱取出細胞，于37℃水浴融化，1000rpm離心5min，棄上清，用含10%馬血清、0.2mg/mL丙酮酸鈉的RPMI 1640培養(yǎng)液（RPMI-10）中重懸細胞；1000rpm再次離心5min，棄上清，用RPMI-10重懸后接種于細胞瓶中培養(yǎng)。

2、自發(fā)突變細胞清除

取對數(shù)生長期細胞懸液，于含1% 的THMG（100×）的*培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，1000 r/min離心5 min，洗滌后于含1%的THG（100×）*培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

注：為確保試驗的可行性，試驗中所用細胞的自發(fā)突變率應在5010^-6~20010^-6之間，清除自發(fā)突變的細胞傳代使用不得超過1個月，每次試驗前需將細胞清除自發(fā)突變。

3、染毒處理

取生長良好的細胞，調(diào)整細胞密度為5×10⁵個/mL（細胞數(shù)可根據(jù)實驗室情況做調(diào)整），在加或不加代謝活化系統(tǒng)的條件下，按1%的體積加入不同濃度的受試物，37℃，70 rpm/min染毒處理3h，每個試驗組平行處理兩份培養(yǎng)物。

（1）S9混合液及染毒用細胞液配制

注：在試驗過程中，需根據(jù)實際需求，調(diào)整配制量。

（2）推薦染毒培養(yǎng)體系配制方案（以4個受試物劑量組為例）

注：染毒時間可根據(jù)實際情況進行調(diào)整，一般為3h~6h，必要時可延長到1個或多個細胞周期。若需進行24小時染毒，所用陽性底物需稀釋3倍后再加入。

4、表達培養(yǎng)

染毒細胞經(jīng)離心洗滌后，重懸細于RPMI-10培養(yǎng)液中，于在細胞培養(yǎng)瓶中表達培養(yǎng)2 d。每天測定細胞密度，計算懸浮生長（SG）、相對懸浮生長（RSG）和細胞相對總生長（RTG），具體方法可參照國標方法要求。

5、突變頻率測定

表達培養(yǎng)2天后，用含20%馬血清、0.2mg/mL丙酮酸鈉的RPMI 1640培養(yǎng)液（RPMI-20）重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×10⁴個/mL，加入TFT（終濃度3 μg/mL），混勻，0.2mL/孔接種96孔板（即2000個細胞/孔），于37℃、5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，10μL/孔加入MTT染色劑，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中放置2~4h，計數(shù)每塊平板有大集落LC和小集落SC生長的孔數(shù)。試驗樣品處理組和陽性對照組每份培養(yǎng)物各設(shè)2個重復；陰性溶媒對照組設(shè)4個重復。

6、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價

數(shù)據(jù)處理方法和結(jié)果判定可參照：476 體外哺乳動物細胞基因突變試驗，化學品測試方法健康效應卷（第二版），中國環(huán)境出版社，2013年（ISBN：978-7-5111-1476-1）；OECD 490等。

注：在染毒處理和表達培養(yǎng)結(jié)束后，均需對平板接種效率進行測定，且要保證PE在70%~130之間，具體可參照國標方法進行。

【注意事項】

1.實驗前請自行準備RPMI 1640培養(yǎng)液、馬血清、丙酮酸鈉、細胞培養(yǎng)瓶、96孔細胞培養(yǎng)板、滅菌槍頭、無菌移液管、二氧化碳培養(yǎng)箱、振蕩器、50mL離心管等，所有耗材需做無菌處理。

2.實驗操作應在符合細胞培養(yǎng)實驗要求的環(huán)境下進行。

3.細胞清除自發(fā)的突變使用的血清建議與正式試驗血清同一廠家同一批號。

4.實驗過程中注意細胞計數(shù)的準確性。