小分子藥物因為其可口服的高便利性，易吸收、易穿透細胞膜的高可成藥性，成為現(xiàn)代藥物開發(fā)的基石。但傳統(tǒng)的小分子藥物采用的是“占位驅(qū)動"模式來抑制蛋白功能，導致包括受體、激酶及通道類型等靶點在內(nèi)的基因僅有約400種可作目標藥物，而已知的可成藥的基因約3000種。因此，“事件驅(qū)動"模式蛋白降解靶向嵌合體（Proteolysis-Targeting Chimera, PROTAC）技術(shù)為新藥研發(fā)提供了新思路，并成為新藥研發(fā)的一大利器。

一、蛋白降解靶向嵌合體簡介

PROTAC是一種異雙功能分子，結(jié)構(gòu)由兩個配體通過Linker連接而成，其中一個配體可結(jié)合目標蛋白（Protein of interest, POI），另一個配體可以靶向E3連接酶。其本質(zhì)是存在于所有真核生物中的天然蛋白降解機制——泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-Proteasome Pathway, UPP）。該途徑涉及一個三酶級聯(lián)反應，即泛素分子在泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）及泛素連接酶（E3）等系列酶作用下，將細胞內(nèi)蛋白質(zhì)分類并選中靶蛋白，并對靶蛋白進行特異性修飾，最終形成靶蛋白多聚泛素鏈并被蛋白酶體識別和降解。其中，E1激活酶和E2結(jié)合酶參與的過程稱為泛素的激活，單獨的泛素本身并沒有任何生物功能，只是一種分子標記蛋白，發(fā)揮作用的前提是必須有ATP來提供能量。

圖片來源：Autophagy and the ubiquitin-proteasome system: collaborators in neuroprotection.

因此，PROTAC是一種“事件驅(qū)動"的模式，即它可以和靶蛋白任何位置結(jié)合，且不需要高親和力，就可以誘導靶蛋白降解。PROTACA分子在進入細胞后，其目標蛋白配體可特異性結(jié)合靶蛋白，另一端可募集E3連接酶，最終形成POI-Linker-E3 Ligase三元復合物，拉近E3連接酶和靶蛋白的距離，從而誘導E3連接酶為靶蛋白貼上泛素標簽，繼而促進靶蛋白的降解。隨著靶蛋白降解而掉落下來的PROTAC分子可繼續(xù)被循環(huán)利用。

圖片來源：Discovery of a first-in-class CDK2 selective degrader for AML differentiation therapy

二、蛋白降解靶向嵌合體體外研究難點

盡管PROTAC因其獨·特作用機制具有突破性的優(yōu)勢，但PROTAC分子的開發(fā)仍面臨大量挑戰(zhàn)。

口服給藥是大多數(shù)疾病治療的理想給藥方式，但PROTAC由于其獨·特的分子結(jié)構(gòu)并不滿足“分子量小于500；氫鍵供體數(shù)目小于5；氫鍵受體數(shù)目小于10；脂水分配系數(shù)小于5和可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量不超過10個"的經(jīng)典小分子藥物類藥五原則。PROTAC分子量通常在600~1200 Da之間，一般可達到700 Da以上，且一般伴有溶解性較差、體內(nèi)外滲透性表現(xiàn)不佳，口服生物利用度通常偏低及吸收較差等情況。

此外，相較于暴露量越多越好的傳統(tǒng)小分子藥物來說，PROTAC由于結(jié)構(gòu)的復雜性，具有新的挑戰(zhàn)。通常，在合適的或相對較低的濃度下，PROTAC可誘導靶蛋白和E3連接酶形成“靶蛋白PROTAC-E3連接酶"三元復合物；然而，當濃度過高時，就易競爭性地出現(xiàn)“靶蛋白-PROTAC"或“E3連接酶-PROTAC"等二元復合物，即“鉤子效應"，導致藥效降低甚至出現(xiàn)毒性積累。因此，適時地調(diào)整PROTAC劑量對于靶向治療至關(guān)重要。

目前現(xiàn)有研究表明PROTAC分子在各種屬中均呈現(xiàn)較高的血漿蛋白結(jié)合狀態(tài)，常規(guī)的血漿蛋白結(jié)合試驗可能無法準確的體現(xiàn)其血漿蛋白結(jié)合率，而血漿蛋白結(jié)合率的測定是必須的。血漿蛋白結(jié)合試驗可測定化合物在血漿中的穩(wěn)定性，以防止化合物在高血漿蛋白結(jié)合率的情況下出現(xiàn)藥物代謝過緩并導致化合物不被清除的現(xiàn)象。同時，PROTAC分子本身結(jié)構(gòu)特殊，分子量大，為提高其滲透性與溶解度，在藥物設計時往往需要引入雜原子，且Linker部分在代謝層面其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生可能發(fā)生藥物毒性作用或藥效不足的現(xiàn)象，因此，對PROTAC分子代謝產(chǎn)物的鑒定至關(guān)重要。

而根據(jù)《藥物相互作用研究技術(shù)指導原則》，了解轉(zhuǎn)運體介導的藥物相互作用也是評價體外藥代動力學的重要內(nèi)容之一。早期常采用Caco2細胞、高表達BCRP細胞或高表達BCRP膜囊泡進行體外評估，然而由于PROTAC分子結(jié)構(gòu)的特殊性，其滲透性一般較差，采用完整的細胞結(jié)構(gòu)可能低估PROTAC分子對外排轉(zhuǎn)運體的抑制作用。

綜上所述，對PROTAC分子進行體外DMPK研究至關(guān)重要，然而，目前尚無定項針對PROTAC藥物研究的指導原則，因此，在實際研究中，研究者往往會參照小分子藥物研究的指導原則。

三、PROTAC體外研究策略

盡管PROTAC是一種暫無指導原則的新興小分子藥物，但它“事件驅(qū)動模式"的功效性促使藥物研發(fā)領頭軍們對其展開了孜孜不倦的研究。目前國內(nèi)部分藥企對PROTAC分子藥物的開發(fā)已接近國際水平并達到了臨床階段。

圖片來源：clinicaltrials, chinadrugtrials,太平洋證券整理

目前常規(guī)檢測化合物的溶解度通常是利用PH 7.4的磷酸緩沖液，但已有研究報道PROTAC分子在不同狀態(tài)下（禁食/非禁食）的腸液中其溶解度顯著不同，即在腸液中PROTAC分子溶解度相對更高，且非禁食狀態(tài)下的溶解度效果優(yōu)于禁食狀態(tài)的腸液。針對滲透性研究，PROTAC分子的研究遵循了常見的體外模型結(jié)構(gòu)，即可利用Caco2、MDCK和LLC-PK1等模型。

而為防止“鉤子效應"、確定血漿蛋白結(jié)合率和代謝產(chǎn)物等情況，對PROTAC分子進行體外代謝研究是至關(guān)重要的！PROTAC分子體外DMPK研究一般也遵循小分子藥物的研究方式，即了解PROTAC藥物的代謝關(guān)鍵酶、選擇合適的體外模型及測定其血漿穩(wěn)定性等。

確定代謝關(guān)鍵酶

對PROTAC進行體外藥代動力學研究，除了基本的I相（CYP酶）代謝和II相（UGT酶）代謝，已有報道發(fā)現(xiàn)醛氧化酶（Aldehyde oxidase, AOX）可參與PROTAC分子的代謝，但存在明顯的種屬差異，需要多種屬驗證確保數(shù)據(jù)真實性。

全血/血漿穩(wěn)定性試驗

作為體外藥代動力學早期研究的試驗之一，全血中含有豐富的水解酶類，可催化藥物的水解代謝，且根據(jù)經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，全血中不穩(wěn)定的化合物一般含有酰胺鍵、磺酰胺鍵、肽鍵及酯鍵等官能團，由此可進一步推斷導致PROTAC在全血中不穩(wěn)定性的位置的可能性。

血漿蛋白結(jié)合率測定

已知PROTAC分子在各種屬中均呈現(xiàn)較高的血漿蛋白結(jié)合狀態(tài)，所以對其進行種屬間比較或體外-體內(nèi)外推（in vitro-in vivo extrapolation, IVIVE）時需充分考慮化合物在孵育體系中的游離率和全血中游離率數(shù)據(jù)。

常見的體外代謝研究模型如下：

鑒于PROTAC分子溶解性對外排轉(zhuǎn)運體研究的影響性，采用高表達BCRP膜囊泡模型更具說服力，即膜囊泡可使ABC轉(zhuǎn)運體的底物結(jié)合位點暴露于細胞外緩沖液中，更適用于研究候選藥物作為底物和抑制劑與ABC轉(zhuǎn)運體的相互作用。

四、IPHASE體外DMPK研究“一站式"產(chǎn)品解決方案

IPHASE作為體外研究生物試劑引·領者，緊隨藥物開發(fā)前沿，針對PROTAC分子藥物體外DMPK研究方向，研發(fā)了多種類、多層次、多領域的體外生物試劑，助力PROTAC藥物臨床前階段研究！

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經(jīng)驗，推出了多領域、多種類的高·端科研試劑，為藥物早期研發(fā)提供篩選工具，為生命科學領域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學品等的遺傳毒性研究提供便捷產(chǎn)品，望廣大科研工作者咨詢。

參考文獻:

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[5] 《藥物相互作用研究技術(shù)指導原則》。

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