N-亞硝胺類雜質(zhì)是一類分子中含有N-亞硝基結(jié)構(gòu)的化合物，它們常以痕量濃度存在于食品、煙草、消毒后的飲用水及塑膠制品中，在藥物的生產(chǎn)和制劑制備過程也會不可避免地會產(chǎn)生或者引入N-亞硝胺類雜質(zhì)。多種Ｎ-亞硝胺類雜質(zhì)具有遺傳毒性風(fēng)險，可造成DNA損傷，進(jìn)而誘發(fā)癌癥。因此，需要對含有Ｎ-亞硝胺類雜質(zhì)的化合物進(jìn)行遺傳毒性檢測，評估其致突變性和致癌性風(fēng)險。

N-亞硝胺類雜質(zhì)

N-亞硝胺類化合物（N-nitrosamines，NAs）是一類含有亞硝基官能團，結(jié)構(gòu)通式為 R1（R2）N-N=O的化合物。其生成機制多樣，包括仲胺類化合物與亞硝酸之間的相互作用，叔胺類化合物與一氯胺之間的親核取代反應(yīng)，溶劑N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的氧化，橡膠硫化劑與空氣中氮氧化合物相互作用等。

N-亞硝胺類化合物在自然界和食品中廣泛存在，如室外空氣、水、土壤、熏肉、烤肉、酒精-飲料、谷物、奶制品、魚類、水果和蔬菜，但含量較少。在藥物的生產(chǎn)和制劑制備過程也會不可避免地會產(chǎn)生或者引入N-亞硝胺類雜質(zhì)。多種NAs具有遺傳毒性風(fēng)險，即化合物存在DNA反應(yīng)活性，可造成無法修復(fù)的DNA損傷，甚至堿基突變，并可進(jìn)而引發(fā)癌癥。遺傳毒性風(fēng)險通常與劑量無關(guān)，存在遺傳毒性的化合物可以在極低劑量水平下導(dǎo)致人體DNA損傷，且該損傷效應(yīng)可通過遺傳物質(zhì)的復(fù)制而不斷放大。

國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）目前已批準(zhǔn)把十余種N-亞硝胺類化合物列入致癌物清單，其中N-亞硝-基二甲-胺（N-dimethylnitrosamine，NDMA）和N-亞硝基二乙胺（N-diethylnitrosamine，NDEA）被歸類為對人類致癌性證據(jù)有限，對實驗動物致癌性證據(jù)充分的2A類致癌物；還有數(shù)種N-亞硝胺類化合物被歸類為對人類致癌性證據(jù)不足，對實驗動物致癌性證據(jù)充分的2B類致癌物。此外，人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（International Coucil for Harmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）評估和控制藥物中DNA反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)的 ICH M7指導(dǎo)原則將致癌風(fēng)險高的NAs列為“關(guān)注隊列"，并基于已知的致癌和致突變數(shù)據(jù)，將其歸為“具有已知致癌致突變性"的Ⅰ類雜質(zhì)，需要得到最為嚴(yán)格的控制。

N-亞硝胺類雜質(zhì)（N-nitrosamines）產(chǎn)生強烈致癌性的遺傳毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)并非原型物質(zhì)，而是其代謝產(chǎn)物。在諸多N-亞硝胺類化合物致癌機制中，當(dāng)前最-廣為接受的是ɑ-羥基化假說，即Ｎ?亞硝胺ɑ-碳上的氫經(jīng)多種氧化酶和氧合酶（如細(xì)胞色素酶P450 CYP2E1和CYP2A6等）羥基化后可形成致癌物。Ｎ?亞硝胺首先被羥化酶激活生成α?羥基化亞硝胺，這是一種不穩(wěn)定且具有誘變性的中間體，可自發(fā)分解成甲醛和甲基重氮羥化物。甲醛可以依次氧化生成甲酸和二氧化碳，甲基重氮羥化物可以分解成烷基重氮離子，它可以與DNA堿基對反應(yīng)，使DNA堿基烷基化生成烷基鳥嘌呤并誘發(fā)致癌反應(yīng)。以NDMA為例，其具體致癌機理如圖１所示。

圖1 NDMA的致癌機理（來源：藥品中N-亞硝胺類有害雜質(zhì)）

并非所有N-亞硝胺類化合物均存在致突變性。隨著對藥品中亞硝胺類雜質(zhì)控制的重視，明確某個亞硝胺類化合物是否具有致突變性是界定其監(jiān)管限度的關(guān)鍵，因此，需要對含有Ｎ-亞硝胺類雜質(zhì)的化合物進(jìn)行遺傳毒性檢測，評估其致突變性和致癌性風(fēng)險。

關(guān)于N-亞硝胺類雜質(zhì)遺傳毒性檢測的增強Ames試驗

Ames試驗，又稱細(xì)菌回復(fù)突變試驗（Bacterial Reverse Mutation Test)，于1975年建立并不斷發(fā)展完善，至今已成為國際上通用的遺傳毒理評價體系的必檢項目，同時也是許多遺傳毒理學(xué)新興技術(shù)發(fā)展過程中對照驗證結(jié)果的試驗之一，廣泛應(yīng)用于化合物的致突變性和潛在致癌性的初篩檢驗。

EMA最新發(fā)布的“Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal product（EMA Q&As指南）"中提到，對N-亞硝胺而言，由于某些N-亞硝胺（如NDMA）在標(biāo)準(zhǔn)Ames試驗的條件下靈敏度低，因此建議采用FDA國家毒理學(xué)研究中心提供的增強Ames試驗（Enhanced Ames Test）的測定條件。因為FDA認(rèn)為，用于Ames測試的標(biāo)準(zhǔn)方法可能不足以表征N-亞硝胺的致突變潛力，在某些情況下會產(chǎn)生已知致突變亞硝胺的陰性結(jié)果。對此，F(xiàn)DA國家毒理學(xué)研究中心一直在測試不同的條件，以開發(fā)增強Ames測試（Enhanced Ames Test），旨在對N-亞硝胺雜質(zhì)潛在致突變性提供更可靠的評估。

以下為FDA提供的增強Ames試驗（Enhanced Ames Test）條件：

需要指出的是，如果在標(biāo)準(zhǔn)的Ames試驗中產(chǎn)生了陽性結(jié)果，則沒有必要使用增強的Ames試驗條件進(jìn)行額外的試驗。 如果標(biāo)準(zhǔn)Ames試驗是陰性結(jié)果，則需要進(jìn)行增強Ames試驗檢測。如果結(jié)果為陰性，還應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)致突變性試驗，因為專家成員一致認(rèn)為，單一的體外突變試驗不足以評估N-亞硝胺化合物的致癌性。如果體內(nèi)致突變試驗結(jié)果也是陰性，則必須進(jìn)行專家知識和全面評估。在得出N-亞硝胺類化合物的非致突變性結(jié)論之前，應(yīng)徹-底評估其致突變性，因此一些N-亞硝胺類雜質(zhì)是非致突變但致癌的，這一點必須要引起足夠重視。

IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

正如前文中提到的，N-亞硝胺類雜質(zhì)（N-nitrosamines）產(chǎn)生致癌性的遺傳毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)是其代謝產(chǎn)物，結(jié)合EMA 關(guān)于亞硝胺雜質(zhì)問答文件中提到的“增強Ames試驗需要使用大鼠肝S9和倉鼠肝S9（Hamster Liver S9）作為代謝活化系統(tǒng)"，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，憑借先進(jìn)的設(shè)備，專業(yè)的技術(shù)人員和多年研發(fā)的經(jīng)驗，繼成功研發(fā)誘導(dǎo)SD大鼠肝S9后，又成功開發(fā)出國內(nèi)-首-家誘導(dǎo)倉鼠（金黃地鼠）肝S9（Hamster Liver S9）。IPHASE誘導(dǎo)倉鼠（金黃地鼠）肝S9是使用苯-巴比-妥-鈉和β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)倉鼠（金黃地鼠）的肝臟制備而成，經(jīng)過了無菌檢查、代謝活性檢測，并以Ames和染色體畸變試驗進(jìn)行質(zhì)控，結(jié)果顯示誘導(dǎo)倉鼠（金黃地鼠）肝S9與誘導(dǎo)SD大鼠肝S9試驗結(jié)果接近，說明倉鼠（金黃地鼠）肝S9符合標(biāo)準(zhǔn)，可滿足體外遺傳毒理試驗需求。

此外，IPHASE現(xiàn)已開發(fā)出了遺傳毒性Ames試劑盒、體外染色體畸變試劑盒等一系列專門用于體外遺傳毒性研究的產(chǎn)品，助力廣大客戶進(jìn)行體外遺傳毒理學(xué)研究。

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參考資料：

[1] Questions and Answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products.EMA,2024.

[2] 曹夢茹，葉志偉，汪雋，等. 藥品中N-亞硝胺類有害雜質(zhì)[J]. 化學(xué)進(jìn)展，2023, 35(12): 1881-1894.

[3] 葉倩，耿興超，張河戰(zhàn)，等. 亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管策略及思考[J]. 中國藥事，2021, 35(2): 127-137.

[4] 葉倩，汪褀，文海若. 不同代謝活化條件對 N-亞硝胺類化合物細(xì)菌回復(fù)突變結(jié)果的影響[J]. 中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2022, 17(2): 118-124.

[5] 于穎潔. 藥物中N-亞硝胺類雜質(zhì)的檢測方法研究[D]. 中國食品藥品檢定研究院. 2021.

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