經(jīng)藥物代謝酶CYP450 IC50抑制體外評估模型解析一文，我們明確了國家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[1]及國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)理事會（ICH）發(fā)布的《M12：藥物相互作用》[2]指導(dǎo)原則對于藥物-藥物相互作用（DDI）研究的目標和方向，即代謝酶介導(dǎo)的藥物相互作用聚焦在底物/酶表型、抑制劑及誘導(dǎo)劑三個方面。經(jīng)過可逆性IC50抑制作用體外模型評估，本篇文章將從藥物體外代謝細胞色素P450（Cytochrome P450, CYP酶）的反應(yīng)表型研究方面進行闡述。

Keywords: CYP450, Cytochrome P450, Enzyme metabolism phenotype, DDI

一、藥物CYP450酶表型代謝研究

藥物代謝鑒定研究，通常被稱為反應(yīng)表型研究，用于確定有助于藥物主要消除途徑的代謝酶的類型、數(shù)量和相對貢獻率。根據(jù)指導(dǎo)原則可知位于肝臟細胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）酶系催化的藥物代謝是人體內(nèi)主要的藥物代謝方式之一，因此，在人體試驗前開展合理的體外代謝試驗評估CYP450酶與在研藥物之間的關(guān)系極為重要！

如果藥物主要通過單一的代謝途徑對藥物進行清除，可能會存在很大的用藥風(fēng)險；反之，如果某一藥物的代謝過程涉及的代謝酶越多，則說明其代謝途徑也越多，也就難以發(fā)生潛在的藥物-藥物相互作用，使得患者之間的治療偏差降低。如下圖所示：以西尼地平為例，IPHASE采用肝微粒體體外溫孵技術(shù)，研究西尼地平與幾種臨床常用藥物間的代謝相互作用的實例，結(jié)果表明環(huán)孢素、紅霉素和辛伐他丁在體外表現(xiàn)出對西尼地平代謝的抑制作用，由于三者均是CYP3A的抑制劑或底物，這提示西尼地平與CYP3A的抑制劑或底物合用時可能會出現(xiàn)代謝上的相互作用，使西尼地平的代謝速率降低，西尼地平二氫吡啶環(huán)脫氫代謝物生成減少，而原型藥物的水平顯著提高，這可能會影響臨床療效的正常發(fā)揮。

綜上所述，如果合用的藥物具有潛在的抑制或誘導(dǎo)代謝酶的能力，則前者將受到合用藥物的影響，從而使其代謝清除途徑發(fā)生量化的改變，這種藥物相互作用可能會影響治療效果，增加藥物的治療失敗率，甚至誘發(fā)不良反應(yīng)。因此，通過對代謝酶表型的體外研究來判定該化合物的主要代謝酶亞型，已成為藥物臨床前代謝研究工作中不可少的一部分。

二、藥物CYP450酶表型代謝研究方法

據(jù)《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則《（試行）》和《M12：藥物相互作用》指出：如果物質(zhì)平衡研究表明代謝是藥物的重要消除機制，基于物質(zhì)平衡研究估計貢獻≥25%藥物消除的代謝途徑涉及的代謝酶通常應(yīng)被鑒定。這適用于CYP酶和非CYP酶。于前者而言，最常研究的是CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4這7種酶亞型。

多種源自人體肝臟的體外系統(tǒng)可用于考察藥物潛在的藥物相互作用。

亞細胞的人肝組織組分，如微粒體系統(tǒng)，肝組織勻漿 9000 g離心后的上清液（S9）和胞漿（必要時加入合適輔因子），建議使用至少有10個供體的混合人肝微粒體（Human Liver Microsomes, HLM）；

源于多種表達系統(tǒng)的重組CYP酶或非CYP酶，可用于考察單一藥物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和特定同工酶的參與；

人肝細胞，包括新鮮制備的肝細胞和冷凍保存（Cryopreserved）的肝細胞，它們可保存細胞及酶結(jié)構(gòu)并包含完整的I相和II相藥物代謝酶。

其中進行CYP450的酶表型鑒定主要使用選擇性抑制劑、重組人源CYP450 同工酶法及相關(guān)性分析法這3種方法。選擇性抑制法又分為化學(xué)抑制法和抗體抑制法，即在加入和不加入一系類CYP450酶亞型選擇性化學(xué)抑制劑或抗體的條件下，分別測定人肝微粒體對藥物的代謝活性，以考察人肝微粒體中CYP450酶亞型倍選擇性抑制后，藥物的代謝是否受到影響，從而計算相對抑制百分率，推斷CYP450酶代謝表型。其中，化學(xué)抑制法由于其操作簡單，且價格低廉而得到廣泛應(yīng)用。

三、藥物代謝酶CYP450代謝表型數(shù)據(jù)分析

鑒于此，IPHASE以肝微粒體為孵育體系，輔以NADPH再生系統(tǒng)，采用化學(xué)抑制法，分別以終濃度為1 μM α-萘黃酮、100 μM 毛果蕓香堿、50 μM 噻氯匹定、10 μM 奎尼丁、100 μM 二乙基二硫代氨基甲酸鈉、1 μM 酮康唑及20μM 磺胺苯吡唑作為CYP 1A2、CYP 2A6、CYP 2C19、CYP2D6、CYP 2E1、CYP 3A4及CYP 2C9等7種亞型酶的特異性選擇性抑制劑，以不含抑制劑的情況為空白對照，測定某一藥物在大鼠、小鼠和人肝微粒體中的主要代謝酶亞型，孵育時長為0min和30min,并采用LC-MS/MS進行原型藥物濃度的檢測。抑制率%=（1- 加入抑制劑樣品代謝速率/空白對照樣品代謝速率）×100%。

以下結(jié)果為結(jié)合真實案例的模擬數(shù)據(jù)，以便與大家共同學(xué)習(xí)成長。

圖1. 大鼠肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖2. 犬肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖3. 人肝微粒中某藥物的代謝抑制率

由上圖可知，不同種屬微粒體中，該候選藥物的代謝抑制率存在明顯差異，即在大鼠中，是CYP2C19為主要代謝酶亞型，而在人中則是CYP1A2，且大鼠和人微粒體的代謝抑制率都表示出了多種酶亞型對某藥物的協(xié)同代謝；相比之下，犬微粒體對該種藥物的代謝僅有3個酶的共同作用，且代謝整體較前兩者而言漸緩。因此，不同種屬微粒體中參與藥物代謝的酶亞型可能不同，這便于更好理解藥物的開發(fā)及應(yīng)用方向。

除化學(xué)抑制法外，IPHASE以HEK293為載體，構(gòu)建人源重組蛋白CYP1A2，以相同藥物進行酶代謝表型試驗驗證。期間，重組CYP1A2終濃度為0.2mg/ml，藥物終濃度為1uM，輔以NADPH再生系統(tǒng)，采用底物消除法，驗證0min，5min，10min及15min時間下的代謝情況，結(jié)果如下圖所示。

綜上所述，我們可觀察到使用IPHASE 重組酶CYP1A2同該藥物進行孵育后，該藥物具有明顯代謝，說明CYP1A2是該種藥物的主要代謝酶亞型之一，符合化學(xué)抑制法的驗證結(jié)果。因此，無論是化學(xué)抑制法還是重組酶法，都可以確認藥物CYP450酶的代謝表型，且兩者相輔相成，可互相支撐。

然而，試驗總是伴隨著不同的結(jié)果，不同的試驗體系也可能出現(xiàn)不同的結(jié)果。因此，IPHASE/匯智和源結(jié)合過去的項目經(jīng)驗，整理并總結(jié)了常見的問題及分析結(jié)果，同大家一同學(xué)習(xí)成長！

1、化學(xué)抑制法和重組酶法結(jié)果不一致時該如何解釋？

答：這兩種代謝系統(tǒng)出現(xiàn)的任何差異都不應(yīng)該叫不一致，而是代謝系統(tǒng)自身的差異導(dǎo)致的正常現(xiàn)象。肝微粒體是直接提取的肝臟的組分，是一種同源的代謝系統(tǒng)，而重組酶是通過蛋白表達系統(tǒng)表達出來的，是一種非同源的測試系統(tǒng)，所以結(jié)論中以化學(xué)抑制法的結(jié)果為主，重組酶法的結(jié)果為輔。

2、是否必須采用化學(xué)抑制法和重組酶法兩種方法試驗？

答：代謝表型研究是定性研究，目前的法規(guī)和行業(yè)觀點都認為單一方法無法得出足夠可靠的結(jié)論，需兩種方法結(jié)合起來做結(jié)論。但一般也認為，結(jié)論中以化學(xué)抑制法的結(jié)果為主，重組酶法的結(jié)果為輔。

3、什么情況下需要考慮進行UGT表型研究？

答：在有證據(jù)表明UGT是主要代謝酶的情況下需要考慮進行UGT表型研究；UGT表型研究只采用重組酶法來進行，并無UGT亞型特異性抑制劑可采用，但需要注意的是，CYP和UGT甚至包括其他的代謝酶，都可能同時是主要的代謝途徑。

IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，以肝微粒體為孵育體系，輔以NADPH再生系統(tǒng)、0.1M PBS緩沖液及CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2C8、CYP3A4和CYP2C9的特異性抑制劑，開發(fā)了化學(xué)抑制法CYP450 酶代謝表型研究試劑盒，最后通過底物消除法確認結(jié)果。此外，為了方便客戶的驗證，IPHASE也以HEK293為細胞載體，自研構(gòu)建多種CYP重組酶，為客戶提供多種選擇！

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