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外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞（Lymphocyte）、單核細(xì)胞（Monocyte）、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和其他少量細(xì)胞。作為在免疫學(xué)、細(xì)胞治療等相關(guān)領(lǐng)域中的寶貴原料，卻在復(fù)蘇階段頻繁使人受挫——細(xì)胞死亡率高、狀態(tài)差、結(jié)團(tuán)率高等問(wèn)題屢見(jiàn)不鮮。因此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，針對(duì)PBMC復(fù)蘇的相關(guān) 問(wèn)題，生成復(fù)蘇protocol，即IPHASE免疫細(xì)胞使用說(shuō)明書(shū)。今天就讓我們來(lái)詳細(xì)了解一下PBMC復(fù)蘇的常見(jiàn)問(wèn)題及正確復(fù)蘇流程。

01    外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）復(fù)蘇的常見(jiàn)問(wèn)題

PBMC是人體免疫系統(tǒng)的核心成分，包含了T細(xì)胞、B細(xì)胞等關(guān)鍵免疫細(xì)胞。它如同一個(gè)“免疫信息寶庫(kù)"，是揭示疾病機(jī)制、評(píng)估免疫狀態(tài)和開(kāi)發(fā)新療法的關(guān)鍵窗口。然而，PBMC的復(fù)蘇總是會(huì)伴有細(xì)胞結(jié)團(tuán)、活性低、狀態(tài)差等問(wèn)題，以下為PBMC復(fù)蘇的常見(jiàn)問(wèn)題及其解決方案。

【問(wèn)題描述】復(fù)蘇后，臺(tái)盼藍(lán)染色下，細(xì)胞活率低。

【解決方案】①避免細(xì)胞解凍時(shí)間多久，凍存管從液氮中取出后，應(yīng)立即放入37℃水浴鍋，順時(shí)針不斷輕柔搖晃，控制在2min內(nèi)融化成冰晶狀態(tài)，轉(zhuǎn)入同樣經(jīng)37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基中。② 確保凍存時(shí)細(xì)胞處于最-佳狀態(tài)，使用程序性降溫盒進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化凍存，并盡量使用新鮮的細(xì)胞及合適的凍存液。

【問(wèn)題描述】細(xì)胞聚集成團(tuán)，在鏡下聚集成大團(tuán)塊，難以計(jì)數(shù)，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

【解決方案】使用移液器輕柔地、多次吹散細(xì)胞團(tuán)塊。避免用力過(guò)猛產(chǎn)生剪切力，損傷細(xì)胞。

【問(wèn)題描述】計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)，忽高忽低。

【解決方案】可能是細(xì)胞未充分混勻、團(tuán)塊未吹散、臺(tái)盼藍(lán)染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短等原因造成的。①重懸細(xì)胞后，立即取樣計(jì)數(shù)；②確保計(jì)數(shù)前細(xì)胞是單顆粒懸液；③臺(tái)盼藍(lán)與細(xì)胞液按建議比例混合后，在1-2分鐘內(nèi)完成計(jì)數(shù)，因?yàn)槿玖媳旧韺?duì)活細(xì)胞也有毒性。

【問(wèn)題描述】?jī)龃鍼BMC，復(fù)蘇后細(xì)胞亞群比例明顯改變。

【解決方案】?jī)龃鍼BMC復(fù)蘇后細(xì)胞亞群比例是否改變與凍存液的凍存效果有關(guān)。凍存效果好的凍存液細(xì)胞凍存復(fù)蘇后活率高，則細(xì)胞亞群比例不會(huì)發(fā)生顯著改變。IPHASE推出的PBMC凍存液細(xì)胞復(fù)蘇后活率＞85%，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

【問(wèn)題描述】?jī)龃鍼BMC能否用于細(xì)胞分選試驗(yàn)。

【解決方案】不同廠家要求不同，IPHASE生產(chǎn)的PBMC可搭配IPHASE細(xì)胞分選試劑盒進(jìn)行后續(xù)分選試驗(yàn)。

綜上所述，外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）的復(fù)蘇小tips也極為重要，畢竟合適的復(fù)蘇流程，是確保細(xì)胞狀態(tài)、進(jìn)行后續(xù)研發(fā)的關(guān)鍵！

02    外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）的復(fù)蘇

以下為IPHASE針對(duì)上述復(fù)蘇難題，結(jié)合自己免疫細(xì)胞專(zhuān)用復(fù)蘇培養(yǎng)基，生成的一整套包含PBMC在內(nèi)的免疫細(xì)胞詳細(xì)復(fù)蘇流程。

【試驗(yàn)試劑】

（1）0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液

（2）免疫細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)基(IPHASE Cell Thaw Medium，Cat.NO.：072008.11、072008.12)

注：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)將 IPHASE Cell Thaw Medium 置于 37℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱，備用。

【試驗(yàn)流程】

（1）解凍：從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，擰松 1/4 管蓋釋放壓力，迅速擰緊并轉(zhuǎn)移到 37℃的水浴中，順時(shí)針輕柔搖動(dòng) 90~120s，至凍存管中只有極小塊碎冰漂浮即可。

注：保持凍存管蓋始終處于水浴鍋液面以上，以防造成細(xì)胞污染。

（2） 轉(zhuǎn)移：從水浴鍋中取出凍存管，用 75%酒精對(duì)凍存管表面進(jìn)行消毒，轉(zhuǎn)移至生物安全柜中。 用寬口（可將普通槍頭剪去尖頭后滅菌）槍頭或巴氏吸管將細(xì)胞懸液吸出，緩慢滴加至裝有 9mL 預(yù)熱的 IPHASE Cell Thaw Medium 的無(wú)菌 15mL 離心管中，并使用預(yù)熱的 IPHASE Cell Thaw Medium 潤(rùn)洗凍存管 2 次，1mL/次，輕微顛倒混勻。

（3） 計(jì)數(shù)：吸取適量細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量和活率的測(cè)定（細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和手動(dòng)計(jì)數(shù)均可）。

（4） 離心：設(shè)置離心力 350g，常溫離心 5-7min 后，棄上清，切勿接觸到細(xì)胞沉淀。

（5） 重懸：先使用 1mL 的 IPHASE Cell Thaw Medium 或后續(xù)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基輕輕吹打懸浮細(xì)胞，再用 IPHASE Cell Thaw Medium 或后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基補(bǔ)齊體積至 10mL。

（6） 二次離心：重復(fù)步驟 2.4。

（7） 再重懸：使用 1mL 的 IPHASE Cell Thaw Medium 或其它適宜的培養(yǎng)基輕輕吹打懸浮細(xì)胞，再補(bǔ)充適量的培養(yǎng)基調(diào)整至適宜的濃度，即可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

注：a.從液氮中取出細(xì)胞開(kāi)始整個(gè)復(fù)蘇操作過(guò)程要迅速，避免影響細(xì)胞復(fù)蘇后的活性。

b.為保證復(fù)蘇效果，請(qǐng)使用 IPHASE Cell Thaw Medium。

c. 為避免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷，整個(gè)操作過(guò)程盡可能輕柔。

經(jīng)IPHASE工作人員驗(yàn)證，使用IPHASE生產(chǎn)的PBMC及相應(yīng)免疫細(xì)胞，配合IPHASE免疫細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)基(IPHASE Cell Thaw Medium，Cat.NO.：072008.11、072008.12)，按照如上操作流程，可得細(xì)胞復(fù)蘇活率在85%以上。

實(shí)例如下：

03    IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，除PBMC外，還有如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，具體產(chǎn)品信息如下。