Keywords：去除維生素A血清；去除維生素A血漿；去除維生素D血清；去除維生素D血漿；去除維生素E血清；去除維生素E血漿；體外診斷；Vitamin A-depleted Serum；Vitamin A-depleted Plasma; Vitamin D-depleted Serum；Vitamin D-depleted Plasma；Vitamin E-depleted Serum；Vitamin E-depleted Plasma；In Vitro Diagnostics; IVD；LC-MS/MS;

體外診斷（In Vitro Diagnostics, IVD）是一種醫(yī)療檢測方法，廣泛應(yīng)用于各種疾病的預(yù)防、診斷、療效觀察等方面，對于提高診斷的準(zhǔn)確性、治療的有效性等情況，具有積極的意義。它通過分析人體的體液、細(xì)胞或組織樣本，為醫(yī)生提供了寶貴的診斷信息，進(jìn)而輔助制定治療計劃。近年來，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛（如新生兒遺傳代謝病篩查、維生素檢測、腫瘤標(biāo)志物檢測、治療藥物監(jiān)測等）。LC-MS/MS法是基于被測生物標(biāo)志物本身分子量、結(jié)構(gòu)等化學(xué)性質(zhì)的直接分析法，相較于其他檢測手段，展現(xiàn)出顯著的競爭力。IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，針對IVD維生素類產(chǎn)品開發(fā)的LC-MS/MS的檢測需求，現(xiàn)已生產(chǎn)出去除維生素A血清（Vitamin A-depleted Serum）、去除維生素A血漿（Vitamin A-depleted Plasma）、去除維生素D血清（Vitamin D-depleted Plasma）、去除維生素D血漿（Vitamin D-depleted Plasma）、去除維生素E血清（Vitamin E-depleted Serum）和去除維生素E血漿（Vitamin E-depleted Plasma）等空白生物基質(zhì)，是體外診斷脂溶性類維生素客戶不-可或-缺的關(guān)鍵基質(zhì)之一！

01    空白生物基質(zhì)的重要性

在質(zhì)譜法體外診斷分析中，空白生物基質(zhì)特指不含目標(biāo)分析物，但保留生物樣品本身的基質(zhì)成分（如蛋白質(zhì)及其代謝物、脂質(zhì)、電解質(zhì)、內(nèi)源性小分子等）的空白生物樣品。

在質(zhì)譜法檢測生物樣本內(nèi)源性物質(zhì)（如維生素、激素、代謝物等）和常見藥物時，空白生物基質(zhì)的重要性貫穿于檢測的全流程，為分析方法的準(zhǔn)確性、可靠性提供至關(guān)重要的保障?？瞻咨锘|(zhì)讓校準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)品與實際樣本處于完-全一致的基質(zhì)環(huán)境中。此時，標(biāo)準(zhǔn)品的離子化行為（受基質(zhì)效應(yīng)影響的程度）與樣本中目標(biāo)物完-全相同，確保目標(biāo)物的信號強度與實際濃度成正比。這是定量準(zhǔn)確性的根本前提。在方法驗證中，空白生物基質(zhì)是加標(biāo)回收實驗的基礎(chǔ)：通過向空白生物基質(zhì)中加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，制備質(zhì)控樣品，計算回收率，才能對樣品前處理（如萃取、凈化）和檢測過程的可靠性進(jìn)行驗證。

因此，合適的空白生物基質(zhì)對于體外診斷試劑盒開發(fā)而言具有重要意義！血液類樣品是體外診斷最主要的樣本類型之一。然而，在臨床診斷中研究者發(fā)現(xiàn)在一些疾病診斷中，血清（Serum）或血漿（Plasma）中的脂溶性維生素（Fat Soluble Vitamins）的含量會干擾對其他指標(biāo)的判斷。因此，為了準(zhǔn)確測定其他物質(zhì)的含量或指標(biāo)的變化，需將血清或血漿中的脂溶性維生素去除。

脂溶性維生素(Fat Soluble Vitamins)是不溶于水而溶于脂肪及非極性有機溶劑(如苯、乙-醚及氯仿等)的一類維生素，包括維生素A、維生素D、維生素E。這類維生素一般只含有碳、氫、氧三種元素，在食物中多與脂質(zhì)共存，其在機體內(nèi)的吸收通常與腸道中的脂質(zhì)密切相關(guān)，可隨脂質(zhì)吸收進(jìn)入人體并在體內(nèi)儲存(主要在肝臟)，排泄率不高；攝入量過多易引起中毒現(xiàn)象，若攝入量過少則緩慢出現(xiàn)缺乏癥狀。另外，脂溶性維生素大多穩(wěn)定性較強。下面為幾種脂溶性維生素主要作用。

 維生素A

（1）增強視網(wǎng)膜感光力參與視紫紅質(zhì)的合成，缺乏時視紫紅質(zhì)合成減少，對弱光敏感性降低，在弱光下視物模糊，稱為夜盲癥；

（2）維持上皮組織結(jié)構(gòu)的完整性和功能參與糖蛋白合成，缺乏時可引起上皮干燥、增生及角化，如皮脂腺角化，出現(xiàn)丘疹；淚腺細(xì)胞角化，淚液分泌減少，眼部干燥，稱為眼干燥癥；

（3）促進(jìn)機體正常生長發(fā)育促進(jìn)骨細(xì)胞的分化，維持成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞之間的平衡；促進(jìn)蛋白質(zhì)、黏多糖及類固醇的合成，缺乏時組織生長發(fā)育不良；

（4）促進(jìn)吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，增強機體免疫力；有效抑制氧自由基的活性，保護細(xì)胞免受傷害，具有一定的癌癥預(yù)防作用。

 維生素D

（1）促進(jìn)鈣、磷在小腸和腎小管的吸收，維持正常穩(wěn)定的血鈣和血磷濃度；

（2）在甲狀旁腺素和降鈣素的協(xié)同下，促進(jìn)骨鈣入血，維持血鈣和血磷的平衡；

（3）促使鈣沉著于新骨形成部位，促進(jìn)生長和骨骼鈣化，促進(jìn)牙齒健。

 維生素E

（1）抗氧化作用能抑制不飽和脂肪酸的氧化，減少過氧化脂質(zhì)的形成以及對機體生物膜的損害，有抗衰老、抗癌及防止動脈粥樣硬化作用；

（2）維持和促進(jìn)生殖功能使促性腺激素分泌增加，促進(jìn)精子生成和運動，增加卵泡生長和孕酮的分泌；

（3）參與多種酶活動增強微粒體中混合功能氧化酶的活性，抑制脫氧核糖核酸等分解酶系統(tǒng)，并對含巰基酶有保護作用；

（4）其他維持毛細(xì)血管的正常通透性，增加血流量，修復(fù)血管壁損傷后的瘢痕，抑制血小板聚集，防止血栓形成；維持骨骼肌、心肌和平滑肌的正常結(jié)構(gòu)和功能。

由上可知，脂溶性維生素主要儲存于肝臟組織中，但在個體其余組織或體液中也均有存在，包括作為體外診斷主要樣本類型之一的血液樣本。血液樣本包含全血、血清和血漿三種類型，其中全血由血細(xì)胞和血漿組成，應(yīng)用于臨床血液學(xué)檢查，如紅細(xì)胞計數(shù)、分類和形態(tài)學(xué)檢查等；血漿是血液加入抗凝劑后，經(jīng)離心分離得到的液體，含有纖維蛋白原、白蛋白、球蛋白以及各種凝血因子，這些成分共同維持著血液的凝固功能；而血清則是血液在體外自然凝固或加促凝劑后分離出的淡黃色透明液體，它主要含有白蛋白、球蛋白及各種無機離子。

血清或血漿中的生理成分與機體組織間液比較接近，更能真實地反應(yīng)機體的生理情況，反應(yīng)其病理改變也更加靈敏。因此，在某些疾病診斷中，為避免脂溶性維生素對于特定疾病或研究的影響，合理的去除血清或血漿中的脂溶性維生素顯得尤為重要！

02    去除脂溶性維生素的方法

由上可知，在一些特殊情況下，需采用合理的方法將血清或血漿中的脂溶性維生素去除。目前市面上常見的維生素去除方法如下：

 有機溶劑提取法：取一定量的血漿或血清樣本，加入適量的乙酸乙酯或氯仿，震蕩，使有機溶劑與維生素D充分混合，離心即可得到不含維生素D的血漿或血清。

【優(yōu)點】操作簡單：步驟較少，易于實施。成本低：所需試劑和設(shè)備較為常見。

【缺點】選擇性差：可能同時提取其他脂溶性物質(zhì)。溶劑殘留：可能影響后續(xù)實驗。

 透析法：使用特定孔徑的透析膜，置于緩沖液中，維生素D可以通過微孔膜，遂去除。

【優(yōu)點】溫和，不破壞樣品中的蛋白質(zhì)和其他大分子；操作簡單，無需復(fù)雜設(shè)備。

【缺點】耗時長，通常需要數(shù)小時至數(shù)天；效率低：對小分子去除效果有限。

 固相萃?。⊿PF）法：使用C18或其它反相柱，先吸附基質(zhì)中的脂溶性成分，而后用有機溶劑洗脫。

【優(yōu)點】選擇型好，能有效分離脂溶性物質(zhì)；樣品損失少：回收率較高。

【缺點】操作復(fù)雜，步驟較多，需優(yōu)化條件；成本較高，固相萃取柱價格較貴。

 色譜法：使用高效液相色譜（HPLC）或氣相色譜（GC）分離并去除維生素D。

【優(yōu)點】高分離度，能精確分離復(fù)雜樣品中的特定成分；靈敏度高，適合微量分析。

【缺點】設(shè)備昂貴，需用專業(yè)儀器；操作復(fù)雜，需專業(yè)人員操作。

 免疫吸附法：使用抗維生素D的抗體，通過免疫吸附去除基質(zhì)中的維生素D。

【優(yōu)點】特異性強，抗體能特異性結(jié)合維生素D；高效，去除效果顯-著。

【缺點】成本高，抗體價格昂貴；操作復(fù)雜，需優(yōu)化實驗條件。

 物理吸附法：先用水解試劑使與蛋白質(zhì)結(jié)合的維生素D分離，使其游離，再利用活性炭等物理方法進(jìn)行吸附去除。

【優(yōu)點】操作簡單，成本較低，無化學(xué)污染，廣譜吸附性，可調(diào)節(jié)性強。

【缺點】受環(huán)境影響較大，吸附選擇性差。

然而，不同的應(yīng)用場景需要適配不同的去除方法。如以上的有機溶劑提取法、SPF法、色譜法及透析法，都不可能避免的會或多或少的改變血漿的性質(zhì)。因此，常規(guī)獲取去除維生素血清/血漿，需采取更溫和的手段，即免疫吸附或物理吸附法。IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，以物理吸附為原理，成功去除了血漿/血清中的維生素。并以維生素D為例，進(jìn)行了去除維生素D血清的LC-MS/MS分析。

03    IPHASE 去除維生素D血清的LC-MS/MS分析

維生素D水平異常往往涉及多系統(tǒng)功能（如視覺、骨骼、凝血、免疫），準(zhǔn)確測定結(jié)果能為臨床決策提供直接依據(jù)（如補充劑量調(diào)整、疾病風(fēng)險分層），尤其對特殊人群（早產(chǎn)兒、慢性病患者、長期服藥者）的健康管理具有不可替代的意義。利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測血清樣本中25-OH維生素D2和25-OH維生素D3，是目前體內(nèi)維生素D檢測的主要手段。

《液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測25-羥維生素D標(biāo)準(zhǔn)化專家共識》指出：質(zhì)控樣本基質(zhì)應(yīng)盡量和患者樣本基質(zhì)保持一致，以減小樣本處理和離子化中的基質(zhì)效應(yīng)。因此，去除25-羥維生素D的血清是該定量分析中不-可或-缺的關(guān)鍵材料，其核心意義在于通過消除基質(zhì)干擾、模擬真實樣本環(huán)境，為準(zhǔn)確、可靠的檢測結(jié)果提供保障，最終支撐臨床診斷、治療監(jiān)測和健康評估。

然而，空白生物基質(zhì)的缺失會直接打破“基質(zhì)匹配"的平衡，對檢測的準(zhǔn)確性、可靠性及應(yīng)用價值造成多重沖擊，也是目前公-認(rèn)的行業(yè)痛點：

（1）定量準(zhǔn)確性顯著下降，結(jié)果嚴(yán)重偏差；

（2）基質(zhì)效應(yīng)無法控制，方法重現(xiàn)性差；

（3）方法驗證受阻，可信度無法確認(rèn)；

（4）臨床決策風(fēng)險劇增，結(jié)果失去參考價值；

（5）替代“人工模擬基質(zhì)"和人工基質(zhì)無法完-全復(fù)制生物基質(zhì)中復(fù)雜的小分子網(wǎng)絡(luò)（如內(nèi)源性代謝物、脂肪酸），無法消除基質(zhì)效應(yīng)，無法模擬分析目標(biāo)物與血清中大分子可能的相互作用。

不同實驗室因使用的替代基質(zhì)不同，可能導(dǎo)致檢測結(jié)果缺乏可比性，跨實驗室數(shù)據(jù)無法互認(rèn)。

鑒于此，IPHASE通過優(yōu)化物理吸附技術(shù)，實現(xiàn)了對血清中維生素D相關(guān)化合物的高效去除，得到去除維生素D空白血清，可應(yīng)用于科研即時檢測、IVD試劑研發(fā)及部分基層臨床調(diào)控等方面。

為驗證IPHASE產(chǎn)品的合格性，IPHASE技術(shù)人員進(jìn)一步利用LC-MS/MS評估了25-羥維生素D去除效果。圖1為去除VD空白基質(zhì)（紅色）和該空白基質(zhì)中添加1 ng/mL 25-羥基維生素D2（藍(lán)色）的檢測結(jié)果，保留時間為4.13 min；圖2為去除VD空白基質(zhì)（紅色）和該空白基質(zhì)中添加1 ng/mL 25-羥基維生素D3（藍(lán)色）檢測結(jié)果，保留時間為4.02 min。前處理方法為液液萃取。結(jié)果顯示：該產(chǎn)品對VD的去除效果良好，產(chǎn)品中25-羥維生素D的殘留大大低于1ng/mL。同時，去除后產(chǎn)品中蛋白濃度，鈉、鉀、鈣、氯等元素含量及脂質(zhì)濃度，均與去除前相當(dāng)（分別通過BCA法、ICP/MS法、元素分析儀法及脂質(zhì)組學(xué)方法檢測）。

圖1 空白血漿去除25-羥基維生素D2及 1ng/mL添加結(jié)果圖

圖2 空白血漿去除25-羥基維生素D3及 1 ng/mL添加結(jié)果圖

利用去除VD血清產(chǎn)品，構(gòu)建了校準(zhǔn)品（8個濃度點，0.5ng/mL-160ng/mL）和質(zhì)控品（25-羥維生素D2：5ng/mL、20ng/mL; 25-羥維生素D3：15ng/mL、70ng/mL），并進(jìn)行了LC-MS/MS分析。表1為利用去除VD血清產(chǎn)品構(gòu)建的25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3的校正-品和質(zhì)控品，進(jìn)行的LC-MSMS方法驗證結(jié)果，分析中采用了同位素內(nèi)標(biāo)。結(jié)果顯示，8個校正-品的校正曲線和2濃度質(zhì)控品的精確度結(jié)果，均表現(xiàn)良好，且基質(zhì)干凈，可在正常檢測水平基礎(chǔ)上延伸下限。校正曲線線性范圍為0.5~160 ng/mL，25-羥基維生素D2線性擬合R=0.9993，截距為0.0226，25-羥基維生素D3線性擬合R=0.9995，截距為0.0305。圖3和圖4分別為25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3校正曲線擬合結(jié)果。

表1 空白血漿制備25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3校正曲線和質(zhì)控樣品結(jié)果

* 注：SD為Standard，QC為Quality Control

圖3 空白血漿25-羥基維生素D2校正曲線（0.5 ~160ng/mL）

圖4 空白血漿25-羥基維生素D3校正曲線（0.5 ~160ng/mL）

04    IPHASE產(chǎn)品

綜上，表明IPHASE去除維生素D血清效果優(yōu)秀，滿足需求。IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，針對IVD維生素類產(chǎn)品開發(fā)的LC-MS/MS的檢測需求，也為滿足不同疾病研究或不同產(chǎn)品開發(fā)的需求，現(xiàn)已生產(chǎn)出去除維生素A血清（Vitamin A-depleted Serum）、去除維生素A血漿（Vitamin A-depleted Plasma）、去除維生素D血清（Vitamin D-depleted Plasma）、去除維生素D血漿（Vitamin D-depleted Plasma）、去除維生素E血清（Vitamin E-depleted Serum）和去除維生素E血漿（Vitamin E-depleted Plasma）等空白生物基，為不同研究需求的客戶提供最完整的產(chǎn)品鏈，節(jié)省時間且節(jié)約成本。

除去除脂溶性維生素的血清及血漿產(chǎn)品外，IPHASE常規(guī)多種屬、多規(guī)格的空白血清及血漿產(chǎn)品種類齊全，真正做到了為客戶提供“一站式"血液類樣本提供服務(wù)。同時，IPHASE也含有糞便、尿液、房水等多類型空白生物基質(zhì)，以供不同需求的客戶選用。

IPHASE生產(chǎn)產(chǎn)品均具有以下優(yōu)勢：

合規(guī)性 產(chǎn)品來源均由正規(guī)渠道獲得，來源清晰。

安全性 生產(chǎn)產(chǎn)品來源均經(jīng)過病原檢測，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全。

高質(zhì)量 生產(chǎn)產(chǎn)品均經(jīng)過嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)控，且同批次數(shù)量多，批次間差異性小。

可定制 可根據(jù)客戶特殊需求，提供特殊種屬、特殊產(chǎn)品的定制服務(wù)。